微生物実験プロトコ−ル集 (仮設) 質問、問い合わせ、苦情はこちらへ
最終更新2010.7.6

INDEX
培地組成 基本的な試薬 
Plasmid・DNAの抽出 酵母のRNAの抽出 形質転換 5-FOAによるURA3遺伝子の脱落
電気泳動アガロースゲル電気泳動SDS-PAGESDS-PAGEゲル作成早見表Urea SDS-PAGE
発現系 Western Blotting
Northern Blotting β-galactosidase assay
顕微鏡観察液胞観察間接免疫蛍光法
Two-hybrid 四分子解析 Gel-shift (EMSA) その他

研究室において頻繁に使用されるテクのマニュアル
Mini-PrepLigationWestern Blotting酵母の形質転換酵母からのゲノムDNA抽出

培地組成  培地計算機

  • Escherichia coli
  • Saccharomyces cerevisiae
    そのあとは.......
    植菌量計算機 
  • 基本的な試薬
  • BPB (Bromo Phenol Blue)泳動色素
  • SDS Sample Buffer (6×)他
  • Ampicillin (抗生物質)
  • Tetracycline (抗生物質)
  • Chloramphenicol (抗生物質)
  • Kanamycin (抗生物質)
  • IPTG
  • X-gal
  • TAE buffer
  • EtBr
     
  • Plasmid・DNAの抽出法
  • Rapid法 (E. coli)
  • PCRでのインサートチェックのための急行plasmid抽出法 (E. coli & S.cerevisiae)
  • SpeedyアルカリSDS法 (E. coli)
  • S.cerevisiaeからのplasmidの抽出
  • S.cerevisiaeからのゲノムDNAの抽出 (オススメ!)
  • TaKaRa Genとるくんを使ったS.cerevisiaeからのゲノムDNAの抽出
     
  • RNAの抽出法 形質転換法 電気泳動 発現系

    Western blotting

    Two-hybrid system 四分子分析 ゲルシフト Northern Blotting

    Beta-galactosidase assay

    その他



    培地組成

    Escherichia coli 用培地 寒天培地の場合はAgarを1.5〜2%加えること。

    LB (Luria-Bertani)培地計算機
    Yeast extract 0.5%, Tryptone 1%, NaCl 1% pH.7.2-7.5 (X 5を凍結保存して利用)

    SOB培地
    Bacto Tryptone 20g, Yeast Extract 5g, 5M NaCl 2ml, 2M KCl 1.25 mlを終量990 mlの水に溶解してオートクレーブ。60度C以下に冷めてから2M Mg solution (1 M MgSO4 ・7H2O + 1M MgCl2・6H2O)を10 ml加える。冷蔵保存し、無菌的に利用する。

    SOC培地
    SOB培地1 literに10 mlの2M グルコース溶液を加える。冷蔵保存し、無菌的に利用する。

    DM培地(大腸菌用最少培地)
    K2HPO4 0.7%, KH2PO4 0.3%, (NH4)SO4 0.1%, MgSO4 ・7H2O 0.01%, Glicose 0.2%, pH. 7.2
    *グルコ−スおよび寒天はその他と別個にオ−トクレ−ブする。
    **JM109株には濾過滅菌したチアミン (10mg/ml)を温度が下がってから終濃度30 μg/mlで添加。

    Saccharomyces cerevisiae用培地 ***寒天培地の場合はAgarを1.5〜2%加えること。

    YPD培地計算機
    Yeast extract 1%, Peptone 2%, Glucose 2%, pH. 5.6-6.0

    SD培地計算機
    Yeast Nitrogen base (w/o amino acids) 0.67%, Glucose 2%, supplement amino acids and pyrimidines 20-50 μg/ml
    --10×conc.作製の場合--
    YNB6.7g, supplement amino acids and pyrimidines(Adenine40mg, Uracil20mg, Histidine20mg, Leucine60mg, Lysine30mg, Trptophan40mg, Methionine20mg)/100ml。
    必要な核酸とアミノ酸を加える。)
    *グルコ−スおよび寒天はその他と別個にオ−トクレ−ブする。

    前胞子形成培地
    Yeast extract 0.8%, ポリペプトン 0.3%, Glucose 10%, Agar 2%

    胞子形成培地
    酢酸カリウム 1%, Yeast extract 0.1%, Glucose 0.05%, Agar 2%


    基本的な試薬

    BPB (Bromo Phenol Blue)泳動色素
    100 mM EDTA, 30% Sucrose, 10% glycerol, 10% キシレンシアノ−ル, 10% Bromo Phenol Blue
    *TaKaRa制限酵素のオマケでついてくる。


    SDS Sample Buffer (6×)
    7 ml 4×Tris-Cl/SDS pH6.8, 3 ml glycerol, 1 g SDS, 1.2 mg bromphenol blue, 0.93 g DTT
    Add H2O to 10 ml

    SDS Sample Buffer (5×)
    2.5 ml 1 M Tris-HCl(pH6.8), 1 g SDS, 3 ml 2-melcaptoethanol, 2 ml glycerol, 1mg bromphenol blue
    add H2O to 10 ml


    Ampicillin
    細菌の細胞壁の合成を阻害. bla遺伝子産物により耐性を獲得.
    50 mg/ml stock (濾過滅菌後、冷凍保存)
    Plate 1枚(20 ml)あたりに20 μl添加

    Tetracycline
    30S リボゾ−ムに結合することでタンパク質の合成を阻害する.
    tet遺伝子産物による膜の修飾によって細胞内への取込みを抑える.
    12.5mg/ml stock (ethanol/water 50% v/v)を濾過滅菌後、-20度で遮光保存(光で分解する!)
    終濃度12.5〜15 μg/mlで使用する.(保存、インキュベートはできる限り遮光する)

    Chloramphenicol
    50S リボゾ−ムに結合することでタンパク質の合成を阻害する. 耐性遺伝子はcat.
    34mg/mlで100% ethanolに溶解 (濾過滅菌後、冷凍保存) .
    終濃度10 μg/mlで使用する.

    Kanamycin
    70S リボゾ−ムに結合することでmRNAのmisreadingをひき起こす. 耐性遺伝子はkan.
    25mg/ml stock (濾過滅菌後、冷凍保存) .
    終濃度50 μg/mlで使用.

    IPTG (isopropyl-b-D-thiogalactopyraoside)
    100 mM stock (濾過滅菌後、冷凍保存)
    Plate 1枚(20 ml)あたりに20 μl添加

    X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indoryl-b-D-galactoside)
    N, N-Dimethylformamideで25 mg/mlに溶解 (冷凍保存)
    Plate 1枚(20 ml)あたりに50 μl添加

    TAE buffer
    アガロ−ス電気泳動用buffer
    50倍濃縮stockを作り利用する。
    50 X TAE Tris 242g, 氷酢酸 57.1 ml, 0.5M EDTA (pH. 8.0) 100 ml,

    エチジウムブロマイド(EtBr) DNAの染色試薬、強力な発癌剤。
    EtBr 1gを100 mlの滅菌水に溶解する。遮光して常温で保存。


    Plasmidの作製・確認・抽出法(→download

    作製(Ligation)
    基本的にベクターよりもインサートの量を多くする。
    コロニーが出たら、次へ進む。

    Rapid Screening for the detection of recombinant plasmids(Rapid法)
    多数のコロニーの中から挿入断片が入ったコロニーを簡便に見つけだす方法。全コロニーをmini prepで精製して制限酵素で確認するのは費用も時間もかかって非効率的なので、まずRapid法でめぼしをつけておいて、入っていそうなコロニ−についてのみmini prepで精製を行い確認をする。 形質転換で出たコロニーはシャーレを16分割して、一枚のシャ−レ当たり16個のplasmidを広げておく。コントロールとして空っぽのベクタ−が入ったE. coli菌体を用いる。

    Rapid-A
    材料 
    Lysis buffer
    (5 mM EDTA, 10% w/v sucrose, 0.25% w/v SDS, 100 mM NaOH, 60 mM KCl, 0.05% w/v bromophenyl blue)

    1. Lysis buffer を100 μlずつサンプルチューブに分注する。
    2. つまようじの頭で菌体を採取し、Lysis bufferに懸濁する。
    3. 37度で5分間インキュベートする。
    4. 14000rpm. 1min遠心
    5. アガロ−ス電気泳動へ

    Rapid-B オススメ!!!
    材料 
    Phe/ChlCracking solution (3% w/v SDS, 50 mM Tris-base, pH12.6)

    1. Cracking solution を50 μlずつサンプルチューブに分注する。
    2. つまようじの頭で菌体を採取し、Cracking solutionに懸濁する。
    3. 65度Cで10分間インキュベートする。
    4. ほぼ等量のPhe/Chlと数μlのBPB色素を加え、祈りを込めてVortex。
    5. 14000rpm. 5min遠心
    6. アガロ−ス電気泳動へ 

    空っぽのベクタ−よりも上にバンドがくれば何かが入っている可能性大(セルフライゲ−ションの可能性もあり)。アルカリSDSへ進め!!!慣れてくると目的のモノかセルフライゲ−ションかわかるようになる。




    PCRでのインサ−ト確認のための急行Plasmid抽出法

    大腸菌 Escherichia coli

    滅菌した爪楊枝でコロニーをつつき、10 μlの滅菌水に懸濁、5分間ボイル、急冷。PCRへ

    酵母 Saccharomyces cerevisiae

    NaOH法 
    滅菌した爪楊枝でコロニーをつつき、10 μlの20 mM NaOHに懸濁、37度Cで5分間加温、氷冷。PCRのテンプレートととして利用

    Zymolyase法
    材料
    Zymolyase溶液 10 mM リン酸バッファー (pH. 7.5), 1.2M Sorbitol, 2.5mg/ml Zymolyase
    滅菌した爪楊枝でコロニーをつつき、10 μlのZymolyase溶液に懸濁、37度Cで5分間加温、氷冷。PCRテンプレートととして利用




    Speedy アルカリSDS法(→download

    材料 
    Solution I  50 mM Tris-HCl (pH. 8.0), 10% Sucrose
    Solution II   1%SDS, 0.2N NaOH (10% SDSと2N NaOHから毎回使用直前に調整)
    Solution III   5 M CH3COOK 60 ml, 酢酸 11.5 ml, 蒸留水 28.5 ml。
    RNase   RNase 10mg/ml、ボイルしてDNase freeにしておく。
    PEG6000  Polyethileneglycol #6000/2.5 M NaCl

    1. LB/Amp培地 5 mlで1晩培養、集菌。
    2. 100 μlのSol.-Iに完全に懸濁。
    3. 200 μlのSol.-IIを混和、氷冷1分。
    4. 150 μlのSol.-IIIを混和、氷冷1分。
    5. 等量のPhe/Chlを加えvortex、室温で遠心 (14000rpm. 5min)
    6. 上層にイソプロパノールを500μl 加え、4度Cで遠心 (14000rpm. 10min)。
    7. 75%エタノールリンス、遠心、Dry。
    8. 10 mg/ml RNaseを1000倍に希釈したTEあるいは滅菌水 50 μlに溶かす。

    さらにきれいにとる場合は、少し濃いRNaseで処理し30 μlのPEG6000を加え氷冷を1時間以上する。遠心後、75%エタノールリンス、遠心、Dry。



    酵母からのplasmidの抽出

    1.
    材料
    Disruption buffer (10 mM Tris-HCl pH.8.0, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% SDS, 2% Triton X-100)
    PCRのテンプレート用としてとるならOK。
    intactなプラスミドをとるのなら、あまりおすすめではない(特にシングルコピーの場合)。

    1. 1.5〜5 mlで1晩以上培養、集菌、洗浄後、200 μlのdisruption bufferに懸濁(注:マルチコピープラスミドなら3mlあれば十分だけど、シングルコピーの場合は10mlくらい培養した方が安心)。
    2. さらに、等量のglass beadsとPhe/Chlを加え激しくVortex (2min)。
    3. 室温で遠心 (14000 rpm, 10min)。
    4. 上層をとりChlを加えVortex、遠心。
    5. 上層をとり1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加える (エタ沈でもかまいません)。
    6. 4度Cで遠心 (14000 rpm, 10 min)、pelettを失わないように上清を除く。
    7. 75%エタノールでリンス、4度Cで遠心 (14000 rpm, 10 min)。
    8. 上清を除いてDry、TE or 滅菌水50 μlに溶解。
    9. RNase処理
    10. 30 μlのPEG#6000/2.5 M NaClを加えやさしく混ぜる、1時間氷冷。
    11. 4度Cで遠心 (14000 rpm, 10 min)、75%エタノールでリンス、Dry、TE or 滅菌水50 μlに溶解。
              (plasmidについては大腸菌に再度形質転換して利用)
    2.
    もう少し収率を上げたい時、intactなプラスミドを確実にとりたい時は.....
    1. 10mlで一晩培養、集菌。
    2. 1Mソルビトール溶液に懸濁後、10mg/mlのZymolyase 100Tを100 μl加える。
    3. 37度Cで1時間incubate
    4. 遠心して、あとはminiprepの要領でプラスミドをとる。



    酵母からのゲノムDNAの抽出

    その1   Best Method!!!(→download

    材料
    Detergent lysis buffer: 2% Triton X100, 1% SDS, 100mM NaCl, 10mM Tris-Cl, 1 mM EDTA pH8.0
    TE buffer (pH8.0)
    Phe/Chl
    RNase (10mg/ml)
    4M ammonium acetate(3M CH3COONa)

    1. 1.5〜5 mlで1晩以上培養、1.5mlエッペンチューブに集菌、洗浄。
    2. 200μlのDetergent lysis bufferとglass beadsを加え、軽くスピンダウン
    3. さらに200μlのPhe/Chlを加え、Full speedでVortex(3-4分間、手袋着用)
    4. TE bufferを400 μlとPhe/Chlを200μl加える。遠心14000 rpm X 5 min5.
    5. 上清を別のエッペンに移し、40 μlの4M ammonium acetateと等量の2-プロパノール(エタノール)を加え遠心(14000rpmx5 min, 4度C)
    6. 75%エタノールでリンス、遠心、ドライ。
    7. 400 μl TEに溶解、3 μlのRNaseを加える、37度Cで5分インキュベート 
    8. Phe/Chl、リンス、ドライの後、50 μlのTEに懸濁する。
       

    その2
    材料
    Solution-I 1M Sorbitol, 100 mM EDTA (pH. 7.5)
    Solution-II 50 mM Tris-HCl (pH.7.5), 20 mM EDTA
    Zymolyase solution 10 mg/ml zymolyase-100T (生化学工業)
    5M CH3COOK, 3M CH3COONa

    1. 1.5〜5 mlで1晩以上培養、集菌、洗浄。
    2. 0.5 mlのSol.-Iに懸濁、ザイモリエ−ス溶液 200μlを加え37度Cで撹拌しながらインキュベート。
    3. 遠心 (14000 rpm, 30秒)、細胞をSol.-II 500 μlと10% SDS 50 μlを加え65度Cで30分間インキュベート。
    4. 5M CH3COOKを200 μl 加えてよく混和した後、氷冷30分。
    5. 上層をとり1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加える (エタ沈)。
    6. 4度Cで遠心 (14000 rpm, 5 min)、上清画分を等量のイソプロパノールと混和。
    7. 4度Cで遠心 (14000 rpm, 10 min)。
    8. 75%エタノールでリンス、4度Cで遠心 (14000 rpm, 5min)。
    9. 上清を除いてDry、TE or 滅菌水200 μlに溶解、5 μlのRNaseで処理30分。
    10. Phe, Phe/Chl処理、イソプロパノ−ルと3M CH3COONaでDNAをイソプロパノ−ル沈殿。
    11. 4度Cで遠心 (14000 rpm, 10 min)、75%エタノールでリンス、Dry、TE or 滅菌水50 μlに溶解。



    Genとるくんを用いた酵母からのDNAの抽出
    材料
    Genとるくん(TaKaRa, 18000円、1回当たり360円)
    とにかく早くて、30分ちょっとでDNAを回収!とっても簡単。大腸菌のアルカリSDS法にソックリ!

    RNAの抽出
    酵母からのRNAの抽出

    材料
    AE buffer (50mM CH3COONa, 10mM EDTA, pH.5.3)
    RNA専用のPhe, Phe/Chl, イソプロパノール3M CH3COONa, Distiled water (DW)、10%SDS、その他クリーングローブなど
    試薬はジエチルピロカ−ボネ−ト処理、オートクレーブしておく。

    1. 集菌、洗浄。   
    2. エッペンチューブにて400 μl AE bufferに懸濁 (チップの先で完全に懸濁する)。
    3. 40 μl 10% SDSを加える、vortex。    
    4. 当量のPheを加え、vortex。
    5. 65度Cで4分加熱。    
    6. ただちに液体窒素 or エタノール/アイスで冷却。    
    7. 室温で融解させてから遠心 (14000 rpm, 2 min)。 
    8. 上層をPhe/Chl処理 (vortex、遠心)。 
    9. 上層を40 μl 3M CH3COONa, 等量のイソプロパノ−ルと混和、 4度Cで遠心 (14000 rpm, 10 min)。 
    10. 75% エタノールでリンス、Dry、〜50 μl のDWに溶解。


    形質転換編
    高価な機械のいらない形質転換法
    高価な機械がなくても試薬さえあれば、いつでもどこでも安上がりにできちゃう方法
    (大腸菌 Escherichia coli)

    カルシウム法
    材料
    Ca-solution (50mM CaCl2, 10mM Tris-HCl, pH 8.0)
    SOC培地

    1. LB培地5mlにてOD610=0.5まで培養(低温で培養するほうが効率がよい)。2.    
    2. 培養液を10〜15 min氷冷3.    
    3. 4度Cで冷却しながら集菌。4.    
    4. 氷冷したCa-solution 2〜3 mlに懸濁、1時間氷冷。5. 
    5. 4度Cで冷却しながら集菌。6. 
    6. 氷冷したCa-solution 100 μlに懸濁、DNA sampleを混和した後、1時間氷冷。7.    
    7. 42度Cでヒートショックを30秒(あるいは120秒)与え、ただちに氷冷。8. 
    8. 氷冷を2分した後、SOC培地あるいはLB培地 2mlに懸濁、37度Cで穏やかに1時間振盪する。9.    
    9. 集菌しplating、12〜18時間培養。



    コンピテントセル作成法(→download
    Deep Freezerか液体窒素に保存すれば1〜2ヶ月は利用可。時間の省略には大変便利!

    (Nojima et al.による方法) Best Compitent cells!!!!
    材料
    Transformatin Buffer (TB)
    950 ml の水に10 mM PIPES (3.0g), 15 mM CaCl2・2H2O (2.2g), 250 mM KCl (18.6g)を溶解しKOHでpH 6.7に調整する。さらにMnCl2・4H2Oを10.9g (55 mM)加え、終量1literにfill up。濾過滅菌後4度Cにて保存。
    SOB培地SOC培地

    1. 50 ml SOB培地(LBで可)でOD610=0.5まで培養(低温で培養するほうが効率がよい)。
    2. 10分間氷冷。
    3. 4度Cで冷却しながら集菌。
    4. 氷冷したTB 16 mlに懸濁、10分間氷冷(しっかり懸濁)。
    5. 4度Cで冷却しながら集菌。
    6. 4 mlの氷冷したTBに懸濁、さらに0.3 mlのDMSOを加え(final 7%)、10分間氷冷。
    7. 100 μlずつエッペンチューブに分注し液体窒素で急冷、そのまま保存(1〜2ヶ月は大丈夫)。
    8. 形質転換する際は氷上でコンピテントセルを溶解し、DNA sampleを加え1時間氷冷 (30分でも十分)。
    9. 42度Cでヒートショックを30秒(あるいは120秒)与え、ただちに氷冷。
    10. 氷冷を2分した後、SOC培地あるいはLB培地 2mlに懸濁、37度Cで穏やかに1時間振盪する(振盪無しでも可、30分でも十分)。
    11. 集菌しplating、12〜18時間培養。

    (ルビジウム法)
    材料
    TransFormatin Buffer (Tfb)
    Tfb-I. (per 200 ml)   CH3COONa 0.588 g ( final 30 mM),rubidium chloride 2.42 g (100 mM), CaCl2 0.294 g (10 mM), MnCl2 2.0 g (50 mM), glycerol 30 ml (15% v/v), pH 5.8 with dilute acetic acid
    Tfb-II (per 100 ml)     MOPS 0.21 g (10 mM), CaCl2 1.1 g (75 mM), rubidium chloride 0.121 g (10 mM), glycerol 15 ml (15% v/v), pH 6.5 with dilute NaOH

    1. 100 ml LB or SOB培地でOD610=0.5まで培養(低温で培養するほうが効率がよい)。2.   
    2. 氷冷 15 min。3.   
    3. 4度Cで冷却しながら集菌。4.   
    4. 40 mlのTfbIに懸濁、 氷冷 15 min。5. 
    5. 4度Cで冷却しながら集菌。6.    
    6. 4 mlのTfbIIに懸濁、 氷冷 15 min。7.   
    7. 100 μlずつ分注、液体窒素で保存。
    8. 形質転換する際は氷上でコンピテントセルを溶解し、DNA sampleを加え1時間氷冷。
    9. 42度Cでヒートショックを30秒(あるいは120秒)与え、ただちに氷冷。
    10. 氷冷を2分した後、SOC培地あるいはLB培地 2mlに懸濁、37度Cで穏やかに1時間振盪する。
    11. 集菌しplating、12〜18時間培養。



    (酵母 Saccharomyces cerevisiae)
    リチウム法

    材料
    TE buffer   10 mM Tris-HCl 1mM EDTA (pH. 7.5)
    Li solution   TE buffer containing 0.2 M Litium acetate
    70% PEG   70% Polyethileneglycol #4000 in D.W.

    1. 50 mlの培地でOD610=1.0まで培養、集菌。2. 
    2. TE bufferで洗浄、集菌。3.   
    3. 4 mlのTE bufferに懸濁、そのうち0.5 mlを滅菌したキャップ付き試験管に分注。4.   
    4. 0.5 ml のLi sol.を加え混和。5.   
    5. 30度Cで1時間ゆるやかに振盪。100 μlずつエッペンチューブに分注。
    6. 10〜30 6.    μgのDNAを混和。7.   
    7. 30度Cで30分 (振盪なし) 。8.   
    8. 115 μlの70%PEGを加え、さらに30度Cで1時間(振盪なし)。9.    
    9. 42度C、30秒〜5分のヒートショック、その後、25度Cにさます。10.   
    10. 1 mlの滅菌水を加え遠心、plating。2〜3日培養。
       




    エレクトロポレーション法

    大腸菌 Escherichia coli

    材料
    氷冷滅菌水、氷冷10%グリセロール

    1. LB培地100mlにてOD610が0.5〜0.6まで培養。
    2. 培養液を5〜10 min氷冷
    3. 4度Cで冷却しながら集菌。
    4. 氷冷した滅菌水100 mlに懸濁、4度Cで冷却しながら集菌。
    5. 再度、氷冷した滅菌水100 mlに懸濁、4度Cで冷却しながら集菌。
    6. 氷冷した10%グリセロール2mlに懸濁、4度Cで冷却しながら集菌。
    7. 2mlの10%グリセロールに懸濁、100 μlずつ分注。
    8. 液体窒素で凍結。
    9. -70度Cで保存。
    10. BioRad GenePulser IIの場合、200オーム、25micro F、2.5kVでElectropolationを行う。

    酵母 Saccharomyces cerevisiae(→download

    材料
    氷冷1Mソルビトール

    1. YPD or SD培地50mlにてOD610が1.0〜1.2まで培養。
    2. 培養液を5〜10 min氷冷
    3. 4度Cで冷却しながら集菌。
    4. 氷冷した1Mソルビトール20mlに懸濁、4度Cで冷却しながら集菌。
    5. 再度、氷冷した1Mソルビトール20mlに懸濁、4度Cで冷却しながら集菌。
    6. 氷冷した10%グリセロール500 μlに懸濁。
    7. 100 μlずつ分注。
    8. BioRad GenePulser IIの場合、200オーム、25micro F、1.5kVでElectropolationを行う。
    9. ただちに1Mソルビト−ル入りのSD選択培地にplating、または、1Mソルビトール入りのSD液体培地で2時間元気づけした後に集菌、ソルビト−ル無しのSD選択培地にplatingする。2、3日30度Cで培養。


    5-FOAによるURA3遺伝子の脱落

    URA3マーカーのプラスミドやhisG-URA3-hisGのカセットを使い遺伝子破壊株を構築した時に、プラスミドやURA3マーカーを脱落させるために使用。

    プレートの作り方
    1)SD plate(勿論uracil入れる)を作る。温度が下がってきたら、5-FOAを直接粉で加える(0.5mg/ml〜1mg/ml)。実際には0.5mg/mlで十分。
    2)菌体を生理食塩水に懸濁し、OD610=0.5くらいにして作ったplateにまく。
    3)出てきたコロニーをSD plateに広げる。
    4)広げた菌体をuracil抜きのplateに塗って生えてこなければOK。





    電気泳動

    アガロ−スゲル電気泳動
    材料
    TAE buffer Mupid2などの泳動装置
    アガロース(Nippon geneのAgaroseSなど)

    1. 三角フラスコなどにアガロ−ス粉末をいれ、TAE bufferを半分入れる。
    2. 電子レンジで加熱する(吹き出さないように注意して時々廻してよく混ぜる)。
    3. 完全に解けたら残り半分のTAE bufferを足して冷ます。
    4. ゲル作成のプレートに注ぎ、冷まして固まらせる。
    5. ゲル濃度は観察したい核酸の大きさで適宜変える。
        
      ***アガロースゲル濃度とおおよその分離範囲***
      ゲル濃度(%) 分離範囲(kbp)
      0.3 5〜60
      0.6 1〜20
      1.0 0.3〜7
      1.5  0.2〜4
      2.0 0.1〜2
                         

    電気泳動

    SDS電気泳動
    材料
    30%アクリルアミドストックsolution=A.A. (アクリルアミドモノマー 29g N, N-メチレンビスアクリルアミド1g fill up with H2O 遮光冷蔵保存) 1.5M Tris-HCl (pH 8.8) 0.5M Tris-HCl (pH 6.8) 10% SDS TEMED 10%APS (過硫酸アンモニウム Ammonium Peroxodisulfate)

    組成表(ミニゲル1枚あたり) 
    濃縮ゲル H2O 2.89ml A. A. 0.79 ml, 0.5M Tris-HCl 1.25 ml, 10% SDS 50 μl, APS 17 μl, TEMED 5 μl
    7.5%ゲル  H2O 3.89ml A. A. 1.99ml, 1.5M Tris-HCl 2.0 ml, 10% SDS 80μl, APS 27 μl, TEMED 4 μl
    10%ゲル   H2O 3.22ml A. A. 2.7 ml, 1.5M Tris-HCl 2.0 ml, 10% SDS 80 μl, APS 27 μl, TEMED 4 μl
    15%ゲル H2O 1.87ml A. A. 4.05 ml, 1.5M Tris-HCl 2.0 ml, 10% SDS 80 μl, APS 27 μl, TEMED 4 μl
    17.5%ゲル H2O 1.2ml A. A. 4.7 ml, 1.5M Tris-HCl 2.0 ml, 10% SDS 80 μl, APS 27 μl, TEMED 4 μl

              H2O, A. A., Tris-HCl, SDSをくわえたのちに脱気、フィルター濾過するほうがベター。

    SDS-PAGEゲル作成早見表(大体ね)

    running gel

    7.5%
    10%
    12.5%
    15%
    17.5%
    枚数(ミニゲル換算)
    一枚
    二枚
    三枚
    一枚
    一枚
    一枚
    二枚
    三枚
    四枚
    一枚
    二枚
    三枚
    水(ml) 3.89 7.78 11.67 3.22 2.55 1.87 3.74 5.61 7.48 1.2 2.4 3.6
    30%アクリルアミド(ml) 1.99 3.97 5.97 2.7 3.38 4.04 8.10 12.15 16.2 4.7 9.4 14.1
    1.5M Tris-HCl(pH8.8)(ml) 2.0 4.0 6.0 2.0 2.0 2.0 4.0 6.0 8.0 2.0 4.0 6.0
    10%SDS(μl) 80 160 240 80 80 80 160 240 320 80 160 240
    10%APS(μl) 27 54 81 27 27 27 54 81 108 27 54 81
    TEMED(μl) 4 8 12 4 4 4 8 12 16 4 8 12

    濃縮ゲル

    枚数(ミニゲル換算) 一枚 二枚 三枚 四枚
    水(ml) 2.89 5.78 8.67 11.56
    30%アクリルアミド(ml) 0.79 1.58 2.37 3.16
    0.5M Tris-HCl(pH6.8)(ml) 1.25 2.50 3.75 5.0
    10%SDS(μl) 50 100 150 200
    10%APS(μl) 17 34 51 68
    TEMED(μl) 5 10 15 20

    アガロースゲルの組成表(30%アクリルアミド使用時、40%アクリルアミド使用時)

    Urea SDS-PAGE
    Ureaを4〜6M程度ゲルに入れると主に膜タンパク質の分解能を上げることが可能。
    作り方は、SDS-PAGEのゲルと同じ。
    Ureaをはかりとり、必要な水を加え、湯煎で溶かす(←ポイント!)。
    冷めないうちに残りの試薬をざっといれ、ゲルを作製(冷やしてしまうとUreaが析出してしまうので急いで)。

    銀染色法

    材料
    250ml 50% methanol
    250 ml 5% methanol
    DTT 溶液 (8.3 μlの1 M DTTを250mlの水に溶かす)
    Silver Nitrate溶液 (0.25g Silver nitrateを250mlの水に溶かす)
    発色液 (15g Na2CO3/500 mlの水、さらに使用直前に250 μlの37% formaldehydeを加える)
    クエン酸 (停止液)

    1. SDS PAGEなどのゲルを50% methanolで洗う(10分、2回)
    2. ゲルを5 % methanolで洗う(10分、2回)
    3. 蒸留水ですみやかにすすぐ(4回)
    4. 250 mlのDTT液に浸す(緩やかに振盪、10分)
    5. 100mlのSilver Nitrate液でリンス、その後、残りのSilver Nitrate液で浸盪(10分)
    6. すみやかにかつ完全に蒸留水ですすぐ(3回)
    7. 発色液200mlでリンス(約一分間)、その後、残りの発色液でお好みの色まで染色。
    8. クエン酸をぶち込み、発色を停止させる(さらにクエン酸水溶液に浸せば完璧)。よく洗浄後、遮光保存。

    PAGEのバンドを素早く検出する方法

    材料
    電子レンジ用のタッパー
    固定液  7.5%酢酸 50%メタノール
    染色液  CBB-R250 0.625g メタノール125ml 酢酸12.5ml DW112.5ml
    (イラストレイテッド5巻68p)
    固定液、染色液ともに使い回しOK。

    1:固定 固定液にゲルを浸し、5分間振とうする。
    2:染色 タッパーに染色液100mlを入れゲルを浸し、軽くラップをする。
        レンジ(強or500W)で1分チンする(目安はラップに水滴が付くくらい)。
    3:脱色 タッパーに蒸留水をいれゲルを浸す、固く丸めたキムワイプをたっぷり入れレンジで沸騰するまでチンして下さい。数回繰り返せばバンドが確認できると思います。そのまま1日放置しておけばバックもきれいに抜けます。

    注意!!タッパーが非常に熱くなります!軍手必須。



    発現系

    pET Vector系
    材料
    大腸菌 BL21 F-, ompT, hsdSB(rB-mB-), gal, dcm 
    Vector    pET-15b (Ampr, T7lacpromoter, 6His Tag Seq. Thrombin cleavable site, Novagen)

    IPTGによる誘導により大量発現が可能。Multi cloning siteとしてはNdeI XhoI BamHIが利用できる。

    発現誘導 (酵母TRXの例 by前田圭子)

    1. 一晩種培養をおこなう。
    2. LB培地に植菌、OD610=1.0まで培養する。
    3. OD610=1.0で、終濃度0.5mMのIPTGを添加、さらに3時間培養する。
    4. 集菌後、培養液1mlあたり50μlの氷冷したリン酸Buffer (20mM NaPB 0.5M NaCl 10mM Imidazole pH 7.4 )を菌体ペレットに対し加え完全に懸濁する。
    5. 菌体を超音波で破砕する(Sonic 20秒、氷冷 40秒を30セット)
    6. 10000 rpm 10min 4Cで遠心。
    7. 上清を回収、0.45 micronのメンブレンで濾過し、濾液をサンプルとする。
    精製(His Trap)
    pET-15bによる発現ではN末側に6個のHis TagがついたFusionタンパク質として発現される。His TagはNi(ニッケル)と錯体を形成・結合するためアフィニティーカラムによる精製が容易に行うことができる。

    材料
    0.1M NiSO   Phosphate Buffer (20mM NaPB 0.5M NaCl pH 7.4)    2M Imidazole (pH7.4)
    Hi Trap Chelating(Pharmacia)   Peristaltic pump

    カラムの準備 (5mlカラムのケース)

    1. 25mlの純水で洗浄。
    2. 2.5mlの0.1M NiSO4 をシリンジでゆっくりと注入 。
    3. 25mlの純水で洗浄 (カラムが青くなる)。
    4. 50mlの開始Buffer(Phosphate Buffer with 10mM Imidazole)でカラムの平衡化を行う。
    *各ステップ終了ごとに下口を一度閉じ、カラムを枯らさないように注意する。
    * *エアが入らないように純水で上口部分を濡らしてからシリンジやチューブを注すとよい。

    サンプルの添加

    1. サンプル(大腸菌をソニック処理したもの、3mlほど)を注入。
    2. 50mlの開始Bufferで洗浄する。
    3. Phosphate Buffer (20mM NaPB 0.5M NaCl pH 7.4)にImidazoleを10〜500mMの濃度勾配で加えた溶出Bufferを30ml注入しカラムに吸着したタンパク質を溶出させる(酵母TRXの場合200〜250mMで溶出する)(10, 20, 50, 100, 300, 500 mMで条件を検討。300mMで溶出されるなら、100mMで過剰にwash(100mlとか)しておくと精製タンパク質がきれいになる)。
    4. さらに500mM Imidazoleを含むPhosphate Buffer 10mlでカラム内のタンパク質を完全に溶出する。
    5. 各フラクションのタンパク質を定量、測定。
    6. 必要な場合はゲル濾過でさらに精製する。
    7. セントリコンなどで濃縮。
    カラムの洗浄
    0.5M NaCl、0.05M EDTAをふくむPhosphate Buffer pH 7.4を50ml通す。
    カラム内に沈殿したタンパク質の除去
    1M NaOHで2時間室温放置後、50mlの純水or Phosphate Bufferで中性に戻す。

    東洋紡MagExtracteor(Code: NPK-701)の場合
    カラムの再利用はできないが頭を使わなくても簡単にできるのでお勧め!!!



    胞子形成

    材料
    前胞子形成培地胞子形成培地YPD培地SD培地

    1. 交配する一倍体菌株 (aα) をそれぞれYPDプレートで2〜3日、30度Cで培養。
    2. 1.のそれぞれの菌体を新たなYPDプレ−ト上で両者をよく混合し、4時間〜1晩、30度Cで培養。
    3. 2.の混合した細胞塊を二倍体のみが生育可能なSD培地に広げ、2〜3日、2〜3日、30度Cで培養。 
    4. 3.で生育してきた2倍体を前胞子形成培地に広げ、2〜3日、30度Cで培養。
    5. 4.の細胞塊を滅菌した爪楊枝でかきとり、胞子形成培地に1cm四方に広げる。
             ***コテコテに厚めに塗るのがコツ。
    6. 25度Cで5日間ほど培養し、顕微鏡で胞子ができているか確認する。
             ***30度Cで培養した場合、胞子形成率が若干低下する。

    ****プレート上でうまく胞子が形成しない場合は胞子形成培地による液体培養するとよい。


    四分子分析

    材料
    薄く (2~3mm) 平らに作ったYPD plate、マニピュレーター、おおきめのカバーガラス
    Zymolyase solution    10 mg/ml 1M Sorbitol      zymolyase-100T (生化学工業)

    1. 1. 胞子形成培地より細胞をかきとり、エッペンドルフチュ−ブ内でZymolyase solutionに溶解。
    2. 30度Cで15〜30min 処理する。
    3. 薄いYPD plateを1 cm X 2 cmに切り取り、大きめのカバ−ガラスの上にのせる。短い方の一辺にzymolyase処理した細胞を塗る。
    4. マニピュレ−タ−で胞子を分離し、たてに四つ並べる。
    5. 4.のYPD 断片を普通のYPD plateに気泡が入らないように重層し30度Cで培養。
    6. でてきたコロニーについて栄養要求性やMating testにより、おのおのの遺伝子型やMating typeの解析を行う。



    Western Blotting

    Sample bufferの組成

    5×Sample Buffer 6×Sample Buffer(その1) 6×Sample Buffer(その2)
    1 M Tris-HCl(pH7.0)2.5ml
    SDS 1g
    DTT 0.79g
    50%グリセロール5ml
    H2Oで10mlにfill up
    1 M Tris-HCl(pH7.0)3ml
    SDS 1.2g
    DTT 0.93g
    グリセロール3ml
    H2Oで10mlにfill up
    7ml 4×Trix-Cl/SDS(pH6.8)
    SDS 1g
    DTT 0.93g
    H2Oで10mlにfill up

    4×Trix-Cl/SDS(pH6.8)
    6.05g Tris base, 0.4g SDS
    Adjust pH6.8 with HCl
    Add H2O to 100ml(フィルター濾過)

    TCAを用いたサンプル調整法(→download

    Western Blottingの手順(→download)
    試薬     4度Cで保存
    Buffer 1 (pH 10.9)     Tris bas 10.9g (0.3 M) MetOH 60 ml (20%) / H2O で300 mlにfill up
    Buffer 2       Tris base 0.9g (25 mM), MetOH 60 ml (20%) / H2O で300 mlにfill up
    Buffer 3 (pH 9.5)     Tris base 0.91g (25 mM), Boric acid 10.5 mg, MetOH 60ml (20%) / H2O で300 mlにfill up

    PBS (Phisphate-buffered saline, pH 7.4)
            MillQ 1 litter 当りNaCl 8g (137 mM), Na2HPO4 (12H2O) 2.9g (8.1 mM), KCl 0.2g (2.68 mM), KH2PO4 2g (1.47 mM)
    Buffer B     PBS including 0.05% Tween20
    Buffer A     PBS including 0.5% ~0.1%skim milk
    Buffer BS   PBS including 0.5%~0.1% skim milk & 0.05% Tween20     

    発色液 4-クロロ--ナフトール 6mg, MetOH 2ml, H2O2 10 μlにBuffer Bを10 ml加える。
     

    手順

    1. 電気泳動後のゲルをBuffer 3に浸し15分、やさしく浸透する。そのあいだに以下の準備を行う。 メンブレン(MiliporeのImmobilon Transfer membraneなど)をメタノールに浸した後、ただちにBuffer 3に浸して5分間浸透。同じサイズのワットマン濾紙をBuffer 1, 2, 3にそれぞれ2枚、1枚、3枚浸しておく。
    2. 下から順にBuffer 3の濾紙3枚、ゲル、メンブレン、Buffer2の濾紙1枚、Buffer 1の濾紙2枚を重ねる(気泡が入らないように注意)、blotterの電極面は水で濡らしておく。
    3. メンブレンサイズの縦X横(cm)X2.5 mAの定電流で20分blotting。
    4. メンブレンをBuffer BSで浸透洗浄(3minを3回)
    5. 1次抗体処理 in Buffer AS (抗体にもよるが1時間以上室温で、あるいは冷蔵庫でover night)。
    6. 浸透洗浄 Buffer Bで10分ずつ3回、引き続きPBSで10分を3回。
    7. 2次抗体処理 in Buffer AS (1時間、室温) 2次抗体にはanti rabbitのhorseradish peroxidase標識を利用。
    8. 浸透洗浄 Buffer Bで10分ずつ3回、引き続きPBSで10分を3回。
    9. 発色液に浸す。発色後は水で洗浄し発色停止、スキャナで取り込み。
     *****発色にはナカライ製ペルオキシダーゼ染色キットイムノブロッティング用もおすすめ!!!金と設備があればECL(ファルマシア)もお勧め!!!

    AP用発色Buffer: 100 mM Tris-HCl (pH9.5), 100 mM NaCl, 25 mM MgCl2

    メンブレンの再利用

    1. メンブレンが乾いていたら、メタノールで浸水処理する。
    2. 0.2 Mグリシン(pH2~3)溶液に5min浸透させる。
    3. PBSやTBSなどでしっかりグリシン溶液を洗い落とす。
    4. 再びブロッキングへ......


    ゲルシフト プロトコール

    操作の流れ
     1)  電気泳動pre-run→2)  DNA ラべリング→3)  DNA-protein 結合反応→4)  電気泳動→5)  オートラジオグラフィー

    1)  電気泳動 pre-run
      ゲルの作成 (1×TAEを含む5%ポリアクリルアミドゲル)
        10×TAE 3 ml, 30%アクリルアミド溶液 5 ml, 10%APS 300 μl, TEMED 30 μl, H2O  でtotal 30mlにfill up
    泳動 buffer  1×TAE

      pre-run 4℃,100V。電流の値が一定になるまで (30分以上)。両極のbufferを循環させながら行う (pHの変化を最小限にするため)。
    2)  DNA ラべリング
       DNAプローブの32Pによる標識
         DNA 沈澱
         10×klenow buffer 2 μl, [a-32P]dCTP  5 μl, 1mM 3dNTP (ATP, GTP, TTP) mix 5 μl, H2O 7 μl, klenow 1 μl
         total 20 μl
    37℃、30分 インキュベートする。 (この間にスピンカラムの用意 ref.バイオ実験 2 ,p132〜)さらに、2 μlの2.5mM 4dNTP mixを添加して、37℃、10分 インキュベートしたのち、80 μlのTEを加えて反応を停止させる。スピンカラムによりプローブを精製する。
    *****TAKARAランダラベリングKit Ver.2利用が最適
    3)  DNA-protein 結合反応
      DNA-protein 結合反応液
         2×結合バッファー***  5 μl, 1mg/ml poly (dI-dC)・poly (dI-dC)  0.5 μl, 5mg/ml BSA  0.5 μl,
    KCl(終濃度が50〜100mM)  1 μl, プローブ(100,000cpm/0.3~0.5mg)  1 μl, タンパク質  2 μl
         total 10 μl
        15分、室温でインキュベート

     ***2×結合バッファー
        1M Tris-HCl (pH 7.5)  0.2ml, 0.5M EDTA (pH 8.0)  40 μl, グリセロール  2.5 ml, 2% Triton X-100  1ml, 1M DTT  20 μl ***(option)
        H2O でtotal 10mlにfill up (-20℃で保存)
    4) 電気泳動
      pre-runしておいたゲルに3)の反応液をのせ、両極のバッファーを循環させながら泳動する (4℃,100V)。
    ※3)の反応液は12.5%グリセロールを含んでいるのでそのままゲルにのせることができる。ただし、泳動がどこまで進んでいるかのマーカーとしてサンプルを加えていないレーンの横にBPBを流す。
    遊離のDNAがゲルから出る前に泳動を止める (5%ゲルの場合、BPBの位置が約60bpの位置に相当) 。
    5)  オートラジオグラフィー
      ref.タンパク質の分子間相互作用実験法 p.74,83〜91, バイオ実験 イラストレイテッド 2  p.132〜135




    Northern Blotting Analysis(電気泳動まで)(→download

    酵母からのRNA抽出(上記のHot Phenol法と同じです)

    特別なキットは使わない!素早くファインな仕事ができればよい。あと、風呂には入っていますか?

    材料*これらの試薬瓶は素手で触らないこと!禁RNase!!試薬はDEPC処理、オートクレーブすること!
    AE Buffer (pH5.3):50mM CH3COONa、10mM EDTA
    10%SDS
    Phenol
    Phenol/Chloroform
    3M Na-acetate
    液体窒素(ドライアイス、エタノールアイスバスでも可)
    DW
    20×MOPS
    (pH7.0):0.4M MOPS,100mM 酢酸ナトリウム,20mM EDTA
    MOPS 83.7gを800mlのDEPC水に溶かす、酢酸ナトリウム13.61gを加える、EDTAを7.45g加える、NaOHでpHを合わせる、DEPC水で1lにメスアップ、オートクレーブにかける*オートクレーブすると黄色くなります、気になるならフィルター滅菌で
    20×SSPE
    (pH7.4):3M NaCl、173mM NaH2PO4 2H2O(or NaH2PO47H2O or NaH2PO412H2O)、25mM EDTA
    175.3g NaCl, 30.7g NaH2PO42H2O(または46.3g NaH2PO47H2Oまたは61.8g NaH2PO412H2O)、7.4g EDTA水に溶かす、NaOHでpHを7.4に合わせる*EDTAが酸性側だと全く溶けないので焦るかもしれない、溶けないとpHもあわせられない、先にNaOHを2g程(〜2.5g迄)入れておくのもいいかも
    DEPC処理:水1lに対してDEPC(diethylpyrocarbonate)を1ml密閉出来るがラズ瓶に入れて、よくふり混ぜる。ふたを緩めてドラフト内で1〜2時間放置、ふたを緩めたままオートクレーブ。

    手順

    1. 菌体の集菌、生理食塩水でwash
      *特にカルシウム処理をした場合きれいにwashしないとうまくRNAがとれない、2回以上はwash
    2. (以下の作業は手袋を装着して。唾とかにも気をつけて!)
      菌体をエッペンチューブに集め、400μlのAEbufferに懸濁
      *ピペッターでよーく懸濁するのが重要、vortex不可!
    3. 40μlの10% SDSを入れてvortex
    4. 440μlのPhenolをいれてよーくvortex
    5. ヒートブロック等で65℃、4分間処理
    6. 液体窒素等で瞬間冷却!
    7. サンプルを室温で溶かして、14000rpm、室温で5分間遠心
      *なかなか溶けないと思います。この間にゲルを作っておくとかエッペンにラベルするとかしましょう。
    8. 上清を新しいエッペンチューブに移し、等量のPhe/Chlを入れてvortex。14000rpm、室温で5分間遠心
    9. 上清を新しいエッペンチューブに移し、1/10量の3M Na-acetateを添加し、1mlのエタノールを加えて(フリーザーに20分〜放置して)、14000rpm、4℃で10分間遠心。
      上清はすてて75%エタノールでリンス、14000rpm、4℃で10分間遠心
      *つまりエタ沈
    10. 上清をすてて乾燥させる、40μlのDEPC水に懸濁する。
      *結構な量の沈殿が見えるはず、風乾した方が溶けるのは早いかも
      **水で溶かしてから分解の可能性が上がる、素早く次のステップへ!

    電気泳動

    1%アガロースゲル100ml分:アガロース 1g:水 77ml:20×MOPS 5ml(これらをレンジで溶かしてから) 37%ホルムアルデヒド(原液)18ml
    *臭くて涙が出ます、作成はドラフトで。ただし乾燥注意!

    1. サンプルの準備
      RNA溶液 27.5μl *必要とあれば希釈する、濃度を統一するのがベター
      20×MOPS 5μl
      ホルムアルデヒド 17.5μl
      ホルムアミド 50μl
    2. これらのサンプルをヒートブロック等で65℃で15分間処理、氷で急冷、サンプルバッファーを添加
    3. 1×MOPSバッファーで泳動する、アプライ量は20〜40μg位

    ここまでを一気にやってしまいます、後は各種参考書のNorthern Blotting の項を見てください

    (全くオススメしないポイント)はRNaseがコンタミして危険なのはRNAを乾燥させて水で溶かしてから(それまではSDSがあったり、Phe/Chl、エタ沈とRNaseが効きにくい状況にある)、Phe/Chlまでは一気にやってしまえばとくに特に試薬のグレードにこだわらなくても失敗しないのではないかと思います。DEPC水で溶かしてから、RNAの量を測定等している間が一番怖い、そこでサンプル数が多いときは40μlのDEPC水にRNAを溶かしたとして、2μlを測定用においておき、残りの38μlのRNA溶液に20xMOPS 6.9μl,ホルムアルデヒド24.2μl,ホルムアミド69.1μlをすぐに入れてしまう(この状態の方がRNaseが効きにくいだろうから)その間におもむろにRNA量を測定して、分量が同じになるようにアプライする


    つづく…


    フィルターの再利用

    ハイブリしたプローブを外して、同じメンブレンを再利用することができる。2回程度。
    1)500 mlビーカーに0.1×SSCと 0.05% SDSをそれぞれ300 mlずつ用意して95℃に加熱する。
    2)メンブレンを順に2分ずつ浸してプローブを外す。
    3)ペーパータオルの上で乾かす(すぐに乾く)
    4)プレハイを始める。→ハイブリ、wash、検出へと続く....。



    β-galactosidase assay(→download


    サンプル調整
    10 mM KPB pH=7.0で菌体をガラスビーズで破砕し、14000 rpm, 4℃で10分遠心。


    測定法
    試薬
    1. Z buffer (Na2HPO4・12H2O 21.5 g (60 mM), NaH2PO4・2H2O 6.24 g (40 mM), KCl 0.75 g (10 mM), MgSO4・7H2O 0.246 g (1 mM))
    2. ONPG (4 mg/ml in 0.1 M KPB pH7.0)
    3. Buffer (10 mM KPB pH7.0)
    4. 1 M Na2CO3

    手順
    1) Z buffer 800 μl, ONPG 160μl, Buffer 50μlへ2-mercaptoethanolをZ buffer 10 mlに対して27 μl加える。
    2)酵素液を加える。
    3)30℃で反応させ、黄色くなったら1 M Na2CO3で反応を止める。420nmの吸光度を測定。


    顕微鏡観察液胞観察間接免疫蛍光法


    FM4-64を用いた液胞染色(→download)

    1)3 ml のSD 培地でOD610=0.5まで培養。
    2)1.5〜2 ml をエッペンチューブへ5000 rpm, 1 min (小型遠心機)で集菌。
    3)49μlのYPDに懸濁、1μlの2 mM FM4-64を加える(final 40μM)
    4)20 min培養 (菌体が沈まないように注意)
    5)生理食塩水を1 ml加えた後、5000 rpm, 1 minで集菌
    6)3 mlのSD培地に懸濁
    7)90〜120 min, 28℃で培養
    8)各種試薬を添加(例)MG処理の場合:空の試験管に培養した菌体を995μl 移し、そこへ5μlの2 M MGを加える(negative controlとして菌体995μlに5μlのH2O加えたものも調製)。→28℃で培養
    9)顕微鏡で観察。
    *試薬の種類が多い場合、濃度をふる際ならびに経時ポイントが多くなる場合は、必要に応じて実験系のスケールアップをする。


    間接免疫蛍光法(→download)

    1 培養液5mlをファルコンチューブにサンプリング。
    2 ホルムアルデヒド470μl(終濃度3.2%)を添加して固定。
    3 室温で30min撹拌(ゆ〜っくり)。
    4 4℃ or 室温 14.000rpm×2minで集菌、KPS buffer (100mM KPB(カリウムリン酸buffer,) 1.2M ソルビトール)1mlでwash。
    5  20?g/mlのZymolyase入りKPS bufferで再懸濁してエッペンに移す。
    *これをKPS bufferに懸濁してovernight可能。
    6 2-メルカプトエタノール2μl加えて37℃10min~60min。*時間は要検討
    7 PS bufferでwash、3000rpmで集菌、ピペットで上清捨てる。
    8 濁っているのが分かる程度にKPSに再懸濁。
    9 マルチウェルプレートにポリリジン10?lをスポット、15min放置してアスピレート。
    DWをスポット、15min放置してアスピレート。
    *以降20μl程度スポット
    10 サンプルをスポットし、10min放置してアスピレート。
    11 冷メタノールをスポットし、6min放置してアスピレート。
    12 冷アセトンをスポットし、30sec放置してアスピレート(プレートに菌がはり付いていればOK)。
    13 15min程度放置して乾燥。
    14 1mg/ml BSA入りPBSをスポット、15min放置してウェルへ固定する。
    15 PBS-BSAで1000倍希釈した一次抗体10μl入れて室温2h放置。
    16 PBS-BSAで10回wash。
    17 300倍希釈した二次抗体入れて1h放置。
    18 PBS-BSAで10回wash。
    19 PBSで1回wash。
    20 1μg/mlDAPI入りPBSをスポット、30sec〜1min放置。
    21 PBSで2回wash。
    22 Mounting mediumスポットし、カバーガラスのせる。
    23 カバーガラスの両端(全辺)をマニキュアでコーティング。

    設置日2004年11月20日


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